研究撷英丨DMD基因深部内含子激活致病性假外显子的报道及家系分析

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研究撷英丨DMD基因深部内含子激活致病性假外显子的报道及家系分析

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Journal of Human Genetics杂志于2025年6月在线发表了《Pseudoexon activating by a deep intronic variant and phenotype variation in a Chinese family with dystrophinopathy》一文，对来自1个中国家系的两例携带DMD基因深部内含子突变（DIV）（c.6913-4037T>G)病例进行了报道，并利用患者来源的肌肉组织和人诱导多能干细胞（IPSC）分化的肌管细胞，在mRNA和蛋白水平鉴定了突变引起的假外显子的生成及其对蛋白表达的影响，并探讨了深部内含子突变与临床表型变异之间的关联。

研究背景

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见且最严重的遗传性肌肉疾病之一，是由位于X染色体上的DMD基因的变异引起的，该基因编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin），已报告DMD基因中超过7000个变异，绝大多数为外显子区域的缺失、重复和点突变。少数DMD病例由于非编码基因组突变，引起了mRNA剪接异常，导致内含子序列保留，从而引起蛋白表达的提前终止，称为假外显子（PE，Pseudoexon）激活。本研究在一个中国DMD家系中发现了一个深部内含子变异，并利用肌肉组织和患者来源iPSCs分化的肌管细胞，从RNA、蛋白质和细胞水平，对该突变引起假外显子激活的致病性进行了分析。

研究结果

临床病例报道

在本研究中，来自同一家系的两位患者被临床诊断为肌营养不良症。

病例1是一名2岁的男孩（III-1）。在3个月大的常规体检显示其血清肌酸激酶（CK）水平显著升高（>20,000 U/L）。运动发育里程碑正常，但在跳跃、跑步和爬楼梯方面有困难。患儿还有双侧小腿肥大及Gowers征阳性。病例2（II-3），是患者III-1的舅舅，6岁时开始出现跑步和跳跃困难。随着年龄增长，运动功能逐渐恶化，双下肢出现明显的肌肉萎缩。两位患者进行了针对DMD基因的多重探针依赖性扩增（MLPA）测试未发现拷贝数变异，且全外显子测序（WES）也未发现可疑致病突变。

对患者 III-1 和 II-3 的肌肉切片进行了H&E染色，发现两位患者均可见明显的肌纤维大小不等的肌营养不良样改变。在患者II-3中，dystrophin蛋白表达部分保留；而患者III-1则表现出更显著的肌纤维大小不等，且dystrophin蛋白几乎完全缺失。

mRNA和蛋白水平的分析

研究者通过基于连锁分析的过滤策略，重新分析了X染色体上的深部内含子和动态变异。最终在DMD基因的内含子47中发现了一个深部内含子变异（DIV）（c.6913-4037T>G），并进一步分析。该家系中的两位女性成员（I-2和II-2）也携带相同的突变（图3A）。

研究者在患者III-1来源iPSC分化的肌管细胞中发现，位于intron47中的一个72bp片段异常插入至exon47与48之间，形成了一个新的假外显子（PE47i）。该异常转录本的激活预测会导致蛋白翻译提前终止，产生一个包含2312个氨基酸残基的截短蛋白（p.Ser2306Lysfs*7），其中包含3个提前终止密码子（图2）。

qRT-PCR结果显示，III-1中正常的DMD转录本显著减少，而异常转录本的表达量为正常转录本的8.2倍，占患者来源肌管总转录本的约89.13%。在肌肉组织中也进行了检测，发现患者肌肉中的正常转录本也显著下降，而异常转录本占总转录本的约96.9%。肌管细胞和肌肉组织中野生型转录本的比例基本一致，肌肉中略低（3.10% vs. 10.87%）。对dystrophin免疫荧光染色的结果也显示与对照组（II-1）相比，患者来源肌管中dystrophin表达明显减少。

小结

本研究验证了 DMD 基因中来自第 47 号内含子的激活假外显子的致病性，展示了诱导多能干细胞及其分化细胞模型在研究剪接相关突变方面的潜在用途。由于DMD基因较长，一些通过常规方法难以检测到的变异，比如深部内含子、复杂的染色体重组、基因倒位等等，需要结合肌肉病理综合分析，从而找出真正的致病的基因，避免遗传咨询漏诊。未来的研究应致力于在更大样本中验证这些发现，并探索纠正异常剪接的潜在治疗方法。

编辑：夏邢宇，焦可馨

审核：朱雯华