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研究撷英丨焉传祝/林鹏飞团队揭示肢带型肌营养不良分子机制及靶向干预研究进展
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10月28日，山东大学齐鲁医院焉传祝/林鹏飞团队在国际知名期刊Brain杂志在线发表题为AAV-based TCAP delivery rescues mitochondria dislocation in limb-girdle muscular dystrophy R7的研究论文。该研究揭示了TCAP基因缺陷致肌纤维内线粒体空间定位异常参与肢带型肌营养不良R7型（LGMDR7）发病的分子机制，并为LGMDR7提供了有前景的靶向基因治疗方案。
主要研究结果
1.构建LGMDR7小鼠模型
基于团队前期研究结果——LGMDR7患者Telethonin蛋白（也称为Titin-cap，缩写为TCAP）表达完全缺失，采用敲除Tcap基因的方式构建了LGMDR7小鼠模型，研究发现模型小鼠和LGMDR7患者有类似的肌无力表型（图1）。
2.LGMDR7小鼠模型骨骼肌存在线粒体分布异常的病理表型
采用SDH染色和超微结构观察发现Tcap-/-小鼠骨骼肌出现类似患者病理上线粒体空间分布异常病理表型——肌膜下线粒体增多，而肌原纤维间线粒体减少。此病理现象常出现在红肌中（图 2）。
3.TCAP蛋白与结蛋白（desmin）相互作用并维持其稳定性
通过体内、体外实验研究发现，TCAP与desmin有直接相互作用。当TCAP缺失时，除正常长度的desmin（称为“longer desmin”）外，还会产生一个截短的desmin，称之为“shorter desmin”。TCAP维持longer desmin的稳定性，使之不被从N端被截断从而产生“shorter desmin”（图3）。
4.TCAP缺失导致desmin细胞骨架的崩塌并由此引发线粒体空间定位异常
Desmin组成III型中间丝，是骨骼肌细胞的细胞骨架，维持骨骼肌中线粒体的正确空间定位。其组装方式见图4。Desmin N端在中间丝装配中起重要作用，故本团队推测shorter desmin的产生会降低desmin中间丝的稳定性。通过WB和免疫荧光染色证明Tcap-/-小鼠的desmin细胞骨架发生崩塌（图 5）。
5.Tcap-/-小鼠红肌中出现线粒体功能障碍
采集出现线粒体分布异常的小鼠股四头肌红肌组织进行蛋白组学分析显示，参与线粒体氧化磷酸化一系列蛋白出现下调。酶活性分析提示线粒体柠檬酸合酶及复合体II酶活性减低。说明这些空间分布异常的线粒体存在能量代谢功能的异常。
6.LGMDR7基因治疗策略
基于LGMDR7的致病机理，研究团队构建了AAV-TCAP载体递送TCAP蛋白，并引入了荧光素酶报告系统以监测模型小鼠体内目的基因表达情况（图 7）。局部肌肉注射的治疗方式明显改善LGMDR7小鼠肌无力表型及线粒体定位异常的病理表型（图8）。AAV-TCAP 药物仅在小鼠骨骼肌中富集，未在其他器官中发现分布（图7）。一次给药至少可维持长达7个月的治疗效果，免疫反应较轻且无明显的毒副作用（图9）。
综上所述，本研究揭示骨骼肌中的结构蛋白TCAP可以通过影响demsin细胞骨架从而引起线粒体空间分布的异常。同时本研究提示，对于特定肌群受累的遗传性肌肉疾病，靶向局部注射给药可以作为一种可选择的治疗策略。
山东大学齐鲁医院神经内科焉传祝教授、林鹏飞副教授为本论文共同通讯作者，博士后吕晓晴为本论文独立第一作者。山东大学齐鲁医院神经内科及山东省罕见病线粒体医学重点实验室为本论文第一及通讯作者单位。感谢主要合作者：山东大学基础医学院遗传学系李曦教授、山东大学基础医学院细胞生物学系刘招舰教授、北京大学第一医院王朝霞/袁云教授团队、福建医科大学第一附属医院王柠/王志强教授团队、复旦大学附属华山医院卢家红/罗苏珊教授团队对本研究的贡献。
此前LGMD相关国内多中心合作研究
- Lv X, Lin F, Wu W, Wang H, Luo Y, Wang Z, Yan C, Lv H, Luo S, Lin P. The clinical features and TCAP mutation spectrum in a Chinese cohort of patients with limb-girdle muscular dystrophy R7. Hum Mol Genet. 2023 Jul 20;32(15):2502-2510. doi: 10.1093/hmg/ddad090. PMID: 37216648.
- Zhong, H., Zheng, Y., Zhao, Z., Lin, P., Xi, J., Zhu, W., Lin, J., Lu, J., Yu, M., Zhang, W., Lv, H., Yan, C., Hu, J., Wang, Z., Lu, J., Zhao, C., Yuan, Y., & Luo, S. (2021). Molecular landscape of CAPN3 mutations in limb-girdle muscular dystrophy type R1: from a Chinese multicentre analysis to a worldwide perspective. Journal of medical genetics, 58(11), 729–736. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2020-107159
- Zhong, H., Yu, M., Lin, P., Zhao, Z., Zheng, X., Xi, J., Zhu, W., Zheng, Y., Zhang, W., Lv, H., Yan, C., Hu, J., Wang, Z., Lu, J., Zhao, C., Luo, S., & Yuan, Y. (2021). Molecular landscape of DYSF mutations in dysferlinopathy: From a Chinese multicenter analysis to a worldwide perspective. Human mutation, 42(12), 1615–1623. https://doi.org/10.1002/humu.24284
审核：赵重波/罗苏珊
- 作者:华山肌病组
- 链接:http://huashanmuscle.com//article/13a56344-f16e-80cb-b292-c981e00bfc9b
- 声明:本文采用 CC BY-NC-SA 4.0 许可协议，转载请注明出处。